Análisis de la Micotoxinas
en pienso

Las micotoxinas son sustancias tóxicas producidas mycotoxigenic fungi por hongos micotoxigénicos en productos agrícolas, principalmente cereales.

Desde el punto de vista de la seguridad alimentaria, las micotoxinas más importantes:
  • Aflatoxinas,
  • Ocratoxina A
  • Zearalenona
  • Fumonisinas
  • Tricotecenos
Entre ellas, las micotoxinas se están convirtiendo en un importante contaminante de piensos y alimentos.
Josefa Tolosa
Licenciado en Medicina Veterinaria y Doctor en Ciencias de la Alimentación.
Profesora Asociada, Universitat de Valencia.
Food Chain

Micotoxinas y Cerales

Los cereales constituyen la materia prima principal en la formulación de los piensos,(Santos et al., 2011), por lo que las micotoxinas se han convertido en uno de los grandes retos del sector ganadero, afectando también a otros eslabones de la cadena, como almacenistas, fabricantes y ganaderos.

Figura 1. Exposición a micotoxinas a través de la ingesta en humanos y animales (Tolosa, 2017)
Food Chain
Uno de los problemas de gran interés es la presencia de micotoxinas en piensos, ya que éstas pueden transferirse a tejidos y productos derivados (carne, leche, huevos) de los animales alimentados con piensos contaminados.(Figura 1).
La seguridad alimentaria es un gran reto del sector ganadero al afectar a la salud animal y, a su vez, a la cadena alimentaria
Analysis

Métodos rápidos de detección

La obligación de aplicar los límites reglamentarios establecidos ha impulsado el desarrollo de técnicas analíticas para el análisis de micotoxinas en alimentos y piensos que cumplan con los sistemas de control y requerimientos de calidad establecidos.
Among the rapid methods are those qualitative or semiquantitative easy to handle methods allowing quick and economic analysis with low instrumental component, primarily used for screening of a large number of samples (González-Sapienza & Venancio, 2011).

La mayoría de los métodos rápidos son ensayos inmunoquímicos basados en el empleo de anticuerpos como elementos de reconocimiento específico de la micotoxina diana, utilizados comúnmente como análisis de rutina en las fábricas de pienso.

Métodos Inmunoquímicos

El principio de funcionamiento de estos métodos es la reacción antígeno-anticuerpo, siendo el antígeno una micotoxina modificada, que una vez producida se convierte en una señal que permite la cuantificación de ésta.
El principal inconveniente de los métodos inmunoquímicos reside en que legalmente los positivos han de confirmarse por técnicas con mayor selectividad, como la espectrometría de masas (EM).
Inmunoensayos

La técnica más empleada es el Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA) competitivo directo (Figura 2), comercializada en forma de kits compuestos de microplacas cubiertas con el anticuerpo de la micotoxina, reactivos y estándares necesarios para realizar el análisis.

Ventajas

Permiten una importante simplificación de la etapa de preparación de las muestras, ya que requieren pequeños volúmenes de muestra y procedimientos de purificación más sencillos.

Método rápido, simple, específico y cuantitativo.

Desventajas

La aparición de reacciones cruzadas con micotoxinas del mismo grupo o las interferencias con la matriz.

Figura 2. Esquema del análisis de micotoxinas mediante ELISA competitivo (Ortiz et al., 2014).
ELISA

El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas se basa en la capacidad de un anticuerpo específico para distinguir la estructura tridimensional de una micotoxina determinada.
La técnica requiere de una extracción sencilla de la muestra con un disolvente.
Tras el desarrollo del kit, se genera una reacción colorimétrica inversamente proporcional a la concentración de micotoxina en la muestra, medida por el lector de ELISA a una absorbancia de 450 nm.

Inmunoensayos basados en membranas: Ensayo Flow-through/Lateral flow test

Se trata de un ELISA competitivo directo que consiste en tiras compuestas de un bloque donde se coloca la muestra, otro donde está el conjugado, una membrana, un bloque adsorbente y una base adhesiva, en la que el anticuerpo anti-micotoxina se une a la superficie de una membrana (Figura 3).

Es un método semicuantitativo, muy sencillo, rápido y estable, siendo una técnica muy útil para tomar decisiones a pie de campo o de fábrica.

Figura 3. Ensayo Flow-Through
Flow-Through Test
Extracción mediante columnas de inmunoafinidad

Las columnas de inmunoafinidad han sido comúnmente empleadas por su facilidad de uso y su alta selectividad.

Tras este lavado, las micotoxinas se eluyen mediante la adición de un disolvente que provoca la desnaturalización de los anticuerpos (Figura 4) (Soriano et al., 2007). Destacan la elevada especificidad, requiere extractos iniciales poco limpios y ofrece altas recuperaciones y pureza de los extractos. Sin embargo, no son reutilizables y presentan un coste relativamente elevado.
Figura 4. Esquema de empleo de columnas de inmunoafinidad
Immunoaffinity
Aunque el método de columnas de inmunoafinidad fue originalmente desarrollado para la cuantificación mediante fluorometría, en la actualidad las columnas han sido utilizadas para la purificación y concentración de las micotoxinas para su detección posterior mediante cromatografía líquida y/o gaseosa.

Métodos instrumentales
Técnicas Cromatografías



Cromatografía líquida de alta resolución
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) constituye la técnica de elección para el análisis de micotoxinas, o para confirmación de resultados positivos por ELISA:
  • Sensibles,
  • Reproducibles
  • Exactos
  • Presentan un mayor grado de automatización.
Las técnicas espectrométricas de absorción y emisión más empleadas son la detección ultravioleta (UV) y la fluorescencia (FL), siendo preferible esta última cuando las micotoxinas presentan fluorescencia natural.
No obstante, el acoplamiento de HPLC a detectores de MS ha permitido el desarrollo de nuevas metodologías para la detección y cuantificación de micotoxinas y el establecimiento de métodos multirresiduo, que abarcan micotoxinas de diferentes familias, convirtiéndose en uno de los métodos de elección para llevar a cabo análisis multi-micotoxina (Tolosa, 2017).
Todo esto, unido a los bajos límites de cuantificación y sobre todo al hecho de que permite confirmar la presencia de micotoxinas de forma inequívoca está haciendo que esta técnica se esté considerando cada vez más como la mejor opción para el análisis de micotoxinas.
Cromatografía de gases(GC)
Cromatografía de gases (GC) is su empleo es menos común debido a que la mayoría de las micotoxinas no son suficientemente volátiles y, por lo tanto, tienen que ser derivatizadas, incrementando el tiempo de análisis.
El principal grupo de micotoxinas analizadas mediante GC son los tricotecenos, obteniéndose límites de detección y coeficientes de variación adecuados previa reacción de silanización (Rodriguez-Carrasco et al, 2012;. Escrivá et al, 2016.).
El empleo de las técnicas cromatográficas requiere de una preparación previa de la muestra, empleándose diferentes métodos de extracción y purificación dependiendo de las micotoxinas a analizar y de la matriz alimentaria, como por ejemplo las columnas de inmunoafinidad u otros procedimientos basados en la extracción sólido-líquido (Quechers, DMFS, etc.) o líquido-líquido (DLLME).
El coste del equipo y de su mantenimiento es elevado y se requiere de un alto grado de preparación del analista, por lo que estas técnicas no son empleadas como primera opción a nivel de campo o fábrica cuando se requieren resultados rápidos, sino más bien como técnicas de confirmación y/o cuantificación.



Prevención de micotoxicosis
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