Hunor Farkaš, Jog Raj y Marko Vasiljević
PATENT CO., Mišićevo, Serbia
¿Qué son las micotoxinas y por qué debemos controlarlas?
El pienso de los animales puede estar contaminado con microorganismos, micotoxinas, subproductos animales, contaminantes orgánicos y metales tóxicos. Esta contaminación tiene efectos negativos, tanto para la salud animal como humana. Entre estos contaminantes, las micotoxinas tienen cada vez más relevancia, convirtiéndose en importantes contaminantes de piensos y alimentos.
Las micotoxinas son producidas como metabolitos secundarios de varios hongos. Los principales hongos productores de micotoxinas son:
- ⇰ Aspergillus
- ⇰ Fusarium
- ⇰ Penicillium
Las micotoxinas puede provocar micotoxicosis, ocasionando importantes pérdidas económicas al sector ganadero debido a la reducción de la productividad, al incremento de la incidencia de enfermedades y a la disminución del rendimiento reproductivo. Las micotoxinas que suponen un mayor riesgo debido a su toxicidad e incidencia son:
- ⇰ Aflatoxina B1 (AFB1)
- ⇰ Deoxinivalenol (DON)
- ⇰ Ocratoxina A (OTA)
- ⇰ Zearalenona (ZEA)
- ⇰ Fumonisinas (FB1 and FB2)
- ⇰Toxinas T-2
¿Cómo podemos detectar las micotoxinas?
Existen numerosos métodos disponibles para la detección de micotoxinas. Los métodos convencionales para el análisis de micotoxinas incluyen:
- ⇰ ELISA
- ⇰ Cromatografía en capa fina (TLC)
- ⇰ Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)
- ⇰ Cromatografía de Gases (GC)
La mayoría de estos métodos emplean una columna de limpieza de extractos en fase sólida y técnicas de inmunoafinidad para evitar interferencias y mejorar la cuantificación de las micotoxinas.
- ⇰ La técnica ELISA es el método de elección cuando se requiere un análisis rápidos, pero debe ir seguida de un análisis mediante LC-MS/MS para su confirmación.
- ⇰ El método LC-MS/MS es el más sensible y preferido para la detección y cuantificación de micotoxinas en muestras de alimento y pienso.
UN VISTAZO RÁPIDO AL MÉTODO DE ANÁLISIS MULTI-MICOTOXINA MEDIANTE LC-MS/MS
Dado que es necesario comprobar la contaminación de los piensos para alimentación animal con micotoxinas, PATENT CO ha desarrollado y perfeccionado un método rápido y sencillo basado en la LC-MS/MS para la determinación y cuantificación de todas las micotoxinas (Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2; Deoxinivalenol, Zearalenona, Fumonisina B1 y B2, T-2, HT-2 y Ocratoxina A) reguladas en el pienso (Directiva de la UE 2002/32/ EC, 2006/576/EC y 2013/165/EU).
El método se basa en el principio de “diluir e inyectar” (“dilute and shoot”) que incluye una fase de extracción en dos etapas y la centrifugación de los extractos.
Para compensar el efecto de matriz* en la fase de ionización por electrospray, los extractos son mezclados con los estándares internos marcados con [13C] para cada grupo de micotoxinas (13C AB1, 13C DON, 13C ZON, 13C OTA, 13C FB1 Y 13C T-2) antes de su inyección en el equipo de LC-MS/MS.
*Efecto de los componentes de la muestra diferentes a la que se quiere analizar sobre un método analítico.
¿CÓMO FUNCIONAL EL MÉTODO LC-MS/MS?
El método LC-MS/MS combina la gran capacidad de separación de la cromatografía líquida (LC) con la alta sensibilidad y especificidad de la espectrometría de masas (MS). Este método consta de los siguientes pasos para cuantificar las micotoxinas presentes en la muestra.
1. EXTRACCIÓN
El primer paso de la técnica consiste en la extracción de las micotoxinas presentes en la muestra (Figura 1).
Figura 1. Procedimiento de extracción para HPLC.
2. INYECCIÓN A HPLC
Tabla 1. Parámetros para la HPLC: Composición, Gradiente, Flujo y Volumen de inyección.
El extracto se inyecta en la columna de LC que contiene una fase estacionaria y pasa por una fase móvil a alta presión (Ver parámetros en Tabla 1).
Las interacciones químicas que se producen entre los componentes de la muestra y las fases estacionaria y móvil determina que tengan diferentes tasas de migración, lo que permite su separación.
3. ENSAYO DE DILUCIÓN ISOTÓPICA ESTABLE (SIDA)
Para compensar el efecto de matriz de la ionización por electrospray, los extractos son mezclados con estándares internos marcados con [13C] para cada grupo de micotoxinas (Tabla 2).
Tabla 2. Estándares internos marcados para cada grupo de micotoxinas.
Figura 2. Ensayo de dilución isotópica estable (SIDA): Cromatograma
4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La muestra es nebulizada e ionizada para obtener partículas cargadas que migran bajo el efecto de un gran vacío a través de múltiples analizadores de masa gracias a la aplicación de campos magnéticos.
Los resultados se expresan en μg/kg o ppb en relación al pienso con un contenido de humedad del 12%
¿QUÉ INGREDIENTES PUEDEN ANALIZARSE Y CÓMO DE FIABLES SON LOS RESULTADOS
El método LC-MS/MS ha sido validado con éxito para:
Maíz
Pienso compuesto
Trigo
Cebada
Harina de soja
Salvado de trigo
Harina de girasol
TMR (Ración Mezclada Total)
Con el fin de valorar este método, los parámetros de rendimiento fueron obtenidos mediante validación interna, añadiendo una mezcla de 11 estándares de 11 micotoxinas a las muestras en blanco, con dos niveles de cuantificación (LOQ y 10xLOQ) y en 12 replicados.
La Desviación Estándar Relativa de Repetibilidad (RSDr) del método fue del 2,3% al 13,4%, y las recuperaciones aparentes oscilaron entre el 62% y el 115% para todos los analitos.
Se concluye que el método de “dilución e inyección”, con la adición de los estándares internos marcados con [13C], es capaz de determinar todas las micotoxinas reguladas en la UE en alimentos y piensos compuestos para alimentación animal.
Prevención de micotoxicosis