Técnicas moleculares para la detección anticipada de hongos micotoxigénicos en los piensos y en sus matrices

Los piensos son sustancias o productos, incluidos los aditivos, procesados, sin procesar o semiprocesados, que se utilizan para alimentar a los animales (Comisión Europea, 2011).

La alimentación del ganado se diseña principalmente con combinaciones adaptadas a las necesidades nutricionales de los animales con unos costes mínimos (Pereira et al., 2019).

Los cereales y los productos a base de cereales son uno de los principales componentes de la alimentación animal y aportan enormes cantidades de nutrientes al ganado (Deepthi y Sreenivasa, 2020).

En muchos países desarrollados, casi el 70% de los cereales cosechados se destinan a la alimentación diaria de los animales, mientras que en los países en desarrollo son consumidos principalmente por los seres humanos (Dass et al., 2007).

A nivel mundial, las industrias de piensos incluyen cereales como el trigo, el maíz, el sorgo, la cebada y la avena. Entre ellos, el trigo y el maíz son los productos básicos clave en la agricultura para la alimentación animal y avícola (FAO, 2009).

Según un estudio mundial, se espera que la demanda de productos agrícolas experimente un crecimiento del 84% entre 2000 y 2050 (FAO y OMS, 2007).

De acuerdo con la Directiva 2002/32/CE, la seguridad de los piensos para aves de corral y animales debe ocupar un lugar destacado, tanto para los gobiernos como para los productores, ya que el consumo de piensos puede suponer ciertos riesgos para la salud de los animales, con consecuencias peligrosas para la cadena alimentaria humana y la industria de producción ganadera (FAO 2009; Comisión Europea, 2015).

Debido a las malas prácticas agrícolas durante las etapas de precosecha, cosecha, postcosecha y almacenamiento, un alto nivel de contaminantes fúngicos productores de micotoxinas se asocia principalmente con los cereales que sirven como ingrediente principal de la fabricación de piensos (Deepa y Sreenivasa, 2017a, Deepa y Sreenivasa, 2017b) (Figura 1).

Figura 1. Procesamiento de las materias primas para piensos.

El riesgo de las micotoxinas

Las micotoxinas son producidas naturalmente por hongos filamentosos de los géneros Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Stachybotrys y Claviceps. Hasta la fecha se han reportado aproximadamente 450 micotoxinas (CAST, 2003).

Debido a su presencia en los piensos y a sus consecuencias para la salud del ganado, algunos grupos de micotoxinas, como las aflatoxinas (AF), las fumonisinas (FB), las ocratoxinas (OTA), los tricotecenos (TRC), la zearalenona (ZEN) y el deoxinivalenol (DON) han sido objeto de estrategias de gestión en la práctica (Smith et al., 2016).

⇰ Las especies de Aspergillus producen principalmente AF y OTA, mientras que las especies de Penicillium producen patulina (PAT) y las fumonisinas, ZEN, DON y tricotecenos son producidos por las especies de Fusarium (Iqbal et al., 2015).

La presencia de hongos micotoxigénicos en los piensos se ha convertido en un problema importante (Kovalsky et al., 2016), ya que el consumo de las micotoxinas presentes en los piensos tiene efectos negativos para la salud que van desde los crónicos hasta los agudos y, en ocasiones, incluso la muerte, además de afectar al rendimiento de los animales, lo que repercute indirectamente en la rentabilidad (CAST, 2003) (Tabla 1).

Organizaciones e instituciones de todo el mundo han restringido el nivel de aceptación de micotoxinas en los piensos para aves de corral y animales, ya que se considera imposible garantizar la ausencia de micotoxinas en los piensos (Smith et al., 2016).

La legislación ha establecido ciertos límites estándar sobre el nivel de contaminación por micotoxinas, que varían en cada país, ya que en las sesiones de toma de decisiones intervienen muchas cuestiones económicas, científicas y políticas.

Por ejemplo, el contenido máximo de AFB₁ en los piensos se ha fijado en 0,02-0,05 ppm y, basándose en estudios, se han recomendado límites para el deoxinivalenol, las fumonisinas, la zearalenona y la ocratoxina A en los piensos (Comisión Europea 2015; Comisión Europea, 2006).

La importancia de la detección de micotoxinas

La presencia de hongos en los piensos no se correlaciona directamente con la aparición de su micotoxina.

Los métodos clásicos basados en el cultivo, utilizados en la detección e identificación de los hongos productores de micotoxinas tienen varias limitaciones:

• ⇰ Requieren mucha mano de obra, dependen del medio ambiente y consumen mucho tiempo.
• ⇰ Tienen una escasa fiabilidad de los resultados y dificultades para la estandarización, entre otros aspectos.

En la actualidad, existe una gran demanda de tecnologías moleculares para detectar hongos micotoxigénicos en los piensos que entran en la cadena alimentaria en las primeras fases (Figura 2).

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método rápido, específico, sensible y seguro que garantiza la detección rápida de la contaminación fúngica en las matrices de los piensos, en comparación con los análisis microbiológicos convencionales, que requieren mucho tiempo y son laboriosos (Rahman et al., 2020).

Los investigadores han incrementado el uso de diversas técnicas moleculares en las industrias de piensos para la detección temprana de hongos micotoxigénicos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR anidada, la PCR cuantitativa (qPCR), la PCR en tiempo real, la PCR de hibridación de captura magnética (MCH-PCR), la PCR de inmunocaptura la PCR in situ, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP), droplet digilet PCR, la PCR cooperativa, la PCR multiplex, la PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), los microarrays de ADN y la hibridación fluorescente in situ (FISH) (Deepa et al., 2021; Deepa et al, 2018) (Figura 3).

Diferentes técnicas moleculares utilizadas para la detección y diferenciación de hongos micotoxigénicos

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes

PCR

METODOLOGÍA

La técnica PCR se utiliza para detectar la contaminación con hongos micotoxigénicos en matrices de piensos y para definir el riesgo potencial para la salud humana y animal.

⇰ Implica una única ronda de PCR con un determinado conjunto de primers, reactivos de PCR y la muestra de ADN, seguida de un sistema de documentación en gel.

APLICACIÓN

Esta técnica se emplea principalmente para la identificación de hongos y la detección de genes específicos.

• Fusarium poae productor de nivalenol (NIV) se detectó mediante un ensayo de PCR que representa la presencia del gen tri7 (Dinolfo et al., 2012).
• La implicación de la contaminación por F. verticillioides en 51 matrices de piensos se confirmó mediante PCR convencional y 69 muestras se asociaron con especies de Fusarium (Deepa et al., 2016a).
• Las muestras de cereales para piensos estaban infectadas con 103 aislados de Fusarium y 64 F. verticillioides productores de fumonisina estaban asociados con el sorgo (Sreenivasa et al., 2007; 2008).
• Entre 108 muestras de piensos, el 45,37% de las mezclas de piensos estaban contaminadas con especies de Fusarium, lo que se confirmó mediante un método de PCR convencional (Deepthi et al., 2017).

• Dass et al. (2009) analizaron 80 mezclas de piensos para aves de corral y 114 piensos para animales en busca de contaminación por Fusarium, informando de 374 especies de Fusarium con cebadores y 244 aislados para cepas específicas de fumonisina con el conjunto de cebadores FUM1.

PCR MULTIPLEX

METODOLOGÍA

En un solo tubo de PCR, permite la combinación de varios cebadores específicos de la especie utilizados simultáneamente para detectar una variedad de hongos micotoxigénicos. Los productos amplificados se analizan mediante electroforesis en gel.

⇰ Con esta técnica, una sola corrida de PCR es suficiente para la identificación de más de un gen a la vez.

APLICACIÓN

• En Brasil se analizaron muestras de maíz asociadas a la contaminación por F. verticillioides y F. subglutinans mediante el desarrollo del gen gaoB que codifica la galactosa oxidasa (Faria et al., 2012).
• Se utilizaron un cebador directo y dos inversos para detectar F. verticillioides productor de fumonisina mediante mPCR (Deepa et al., 2016c).
• Se detectaron especies de Aspergillus productoras y no productoras de aflatoxinas en meju, utilizándose dos conjuntos de cebadores para amplificar los genes (omtB, omtA, aflR, ver-1), conjunto I (omtB-1,2, aflR-1,2 y omtA-1,2) y conjunto II (aflR-1,2, ver-1-F-R y omtA-1,2) (Kim et al., 2011). Simultáneamente, cinco genes principales, pks (ocratoxina A), pks13 (zearalenona), aflr (aflatoxina), tri5 (tricoteceno) y fum13 (fumonisina) producidos por Aspergillus, Fusarium y Penicillium fueron detectados utilizando un ensayo de PCR multiplex para matrices de piensos (Priyanka et al., 2015).
• Cuatro genes importantes relacionados con las micotoxinas, fum13 (fumonisina), nor1 (aflatoxina), Tri6 (tricoteceno) y otanps (ocratoxina A) se detectaron simultáneamente en una sola prueba mediante un método de PCR múltiplex específico y sensible (Rashmi et al., 2013).

• Se detectaron las fumonisinas (FUM1, FUM13), y los tricotecenos (tri5, tri6) en matrices de piensos utilizando mPCR (Ramana et al., 2011).

PCR ANIDADA

METODOLOGÍA

Este método implica dos reacciones consecutivas en un solo tubo cerrado, en el que el par de cebadores externos amplifica un gran amplicón utilizado como plantilla para el cebador interno que requiere una temperatura más alta que el cebador externo y donde el cebador interno no se unirá (Porter-Jordan et al., 1990).

El método es rentable y 100 veces más sensible que otros métodos. Aunque el riesgo de contaminación puede ser mayor debido a los dos ciclos de amplificación, esta técnica aumenta el rendimiento y la especificidad de la amplificación del ADN objetivo (Rahman et al., 2013).

⇰ El método de PCR anidada es una prueba de doble confirmación, ya que, si el primer cebador se une y amplifica una secuencia de ADN no deseada, el segundo conjunto de cebadores también se unirá dentro de la región no deseada.

APLICACIÓN

• Klemsdal y Elen (2006) detectaron Fusarium culmorum en matrices de piensos de cultivos de cereales donde el par de cebadores externos (FculAF, FculAR) se diluyó 10.000 veces en comparación con el par de cebadores internos (FculBF, FculBR) con un límite de detección de 5-50fg de ADN objetivo.
• F. verticillioides productor de fumonisina asociado a cereales de matriz alimentaria se detectó utilizando un cebador directo (VERF-1) y dos inversos (VERTR y VERTF-2) (Deepa et al., 2016b).

PCR EN TIEMPO REAL (qPCR)

METODOLOGÍA

Este método detecta los amplicones de las moléculas de ADN objetivo basándose en la emisión de señales fluorescentes, lo que elimina los pasos de post-amplificación necesarios en el método de PCR convencional, lo que reduce el tiempo invertido. Detecta pequeñas concentraciones y es útil incluso para identificar en infecciones asintomáticas.

APLICACIÓN

• Aunque puede ayudar a detectar infecciones asintomáticas, la tecnología qPCR no es eficaz cuando se aplica a los piensos (Ginzinger, 2002).

RT-PCR

METODOLOGÍA

Esta técnica se desarrolló para distinguir los hongos vivos de los muertos, ya que el ARNm se degrada rápidamente en las células muertas. Durante el proceso, el ARNm se transcribe de forma inversa para producir ADNc como plantilla mediante una enzima transcriptasa inversa (Brown et al., 2011).

APLICACIÓN

• Se detectó F. graminearum mediante el método RT-PCR en una matriz de piensos. El método es específico y altamente sensible para detectar hongos micotoxigénicos en los piensos. Sin embargo, también es más caro y laborioso que cualquier otro método (Guo et al., 2005).

Métodos basados en la PCR

PCR-RFLP

METODOLOGÍA

Este método es útil para discriminar a nivel de especie con precisión, sensibilidad y especificidad.

⇰ El RFLP registra la variabilidad genética entre las distintas y mismas especies mostrando una diferenciación genética que se corresponde con los perfiles patógenos y micotoxicológicos.

APLICACIÓN

• Se detectaron especies de Aspergillus productoras de aflatoxinas, como A. flavus y A. parasiticus, en matrices complejas de alimentos y piensos (Ahmad et al., 2014).
• Se describió la diferenciación por ITS-RFLP entre F. verticillioides y F. proliferatum (Visenti et al., 2012).
• El método PCR-RFLP se aplicó para detectar variaciones entre 33 cepas de F. verticillioides productoras de fumonisina procedentes de matrices de piensos (Patino et al., 2006).
• Se estudiaron las variaciones genéticas entre diez cepas de F. verticillioides utilizando seis enzimas diferentes (EcoRI, Xho I, Hae III, Kpn I, Hinf I, Hind III) aisladas de muestras de cereales (Deepa et al., 2018).

PCR-AFLP

METODOLOGÍA

El polimorfismo de longitud de fragmento amplificado-PCR es una técnica diseñada para detectar polimorfismos de ADN.

⇰ La caracterización micotoxicológica y de patógenos fúngicos puede complementarse con el fingerprinting. El método es altamente reproducible, sensible y tiene la capacidad de amplificar 100 fragmentos a la vez.

APLICACIÓN

El método se aplicó para estudiar la variabilidad genética entre 3.840 granos de maíz en Brasil y FUM1 y FUM8 fueron los genes esenciales responsables de la biosíntesis de fumonisina entre las especies de F. verticillioides (Silva et al., 2017).

PCR-RAPD

METODOLOGÍA

El ADN polimórfico amplificado al azar identifica las diferencias genotípicas utilizando cebadores de oligonucleótidos cortos para distinguir las especies de hongos micotoxigénicos y las variaciones dentro de la especie (Zhang et al., 2018).

⇰ Aunque el método se utiliza como herramienta de diagnóstico en los laboratorios, no se usa mucho en la práctica ya que carece de reproducibilidad (Blackwell et al., 1999).

APLICACIÓN

• Se identificaron F. subglutinans y F. verticillioides en granos de maíz basándose en las secuencias RAPD de los fragmentos (Moller et al., 1999).
• El método RAPD-PCR se aplicó en diez cepas de F. verticillioides asociadas a muestras de cereales para estudiar la variación genética entre ellas (Deepa et al., 2018).

Métodos acoplados a PCR

PCR in situ

METODOLOGÍA

Esta técnica es una combinación de PCR e hibridación in situ para detectar hongos micotoxigénicos en tejidos o células (Long, 1998) que se ha convertido en algo común para analizar la expresión de genes e identificar ADN o ARN en las células (Chu et al., 2019). Por lo general, la amplificación del ADN de las materias primas conduce a una interpretación errónea si el material contiene más de una especie.

PCR-DGGE

METODOLOGÍA

Técnica que detecta comunidades fúngicas mediante la amplificación del ADN diana, inicialmente mediante PCR, y posteriormente sometida a electroforesis, pero que no sirve para describir las especies presentes en la muestra (Laforgue et al., 2009).

APLICACIÓN

• Con este método se detectaron esporas de Trichoderma harzianum procedentes de matrices de alimentos. El método se aplica principalmente en estudios de diversidad y para detectar hongos patógenos, aunque es una técnica que requiere mucho tiempo y es poco reproducible (Rytkonen et al., 2011).

Métodos de postamplificación

LAMP

METODOLOGÍA

La amplificación isotérmica mediada por bucle (Loop-mediated isothermal amplification) es una técnica altamente sensible y exitosa que se aplica directamente in situ para garantizar la calidad y la seguridad de los alimentos, amplificando el ADN objetivo en menos de una hora a una temperatura constante mediante el uso de cuatro cebadores para identificar seis regiones en el ADN diana con especial atención en el paso de recocido (Tomita et al., 2008).

APLICACIÓN

• Se detectó rápidamente Penicillium nordicum productor de ocratoxina directamente in situ en cadenas de producción de alimentos y piensos (Ferrara et al., 2015).

ARRAYS DE ADN

METODOLOGÍA

La tecnología de arrays de ADN se desarrolló para detectar un gran número de organismos a la vez. Incluye las técnicas de microarrays y macroarrays, en las que se fijan secuencias detectoras específicas de cada especie, colocadas de forma diferenciada, en filtros de nailon o en un portaobjetos de cristal. Este método se aplica principalmente en los estudios de expresión génica.

⇰ Los microarrays consisten en un chip de ADN para analizar miles de ARNm simultáneamente, se utilizan principalmente para estudios de expresión génica y se aplican para la identificación de especies de Aspergillus (Singh y Kumar, 2013).

⇰ Los macroarrays implican una técnica de hibridación de ADN y se utilizan principalmente para la identificación de A. alternata, F. solani y A. fumigatus en matrices de alimentos (Singh y Kumar, 2013).

APLICACIÓN

• Kristensen et al. (2007) aplicaron la tecnología de microarrays para la detección de especies de Fusarium, lo que parece ser fácil, seguro, rápido y rentable en matrices de piensos y alimentos. La detección de especies de Fusarium que producen 14 tricotecenos y moniliformina se determinó mediante un microarray de ADN.

Nuevas tecnologías emergentes para la detección de micotoxinas

Además de los métodos cromatográficos (cromatografía en capa fina, cromatografía de gases y cromatografía líquida) y de los métodos basados en inmunoensayos (membranas de flujo, ELISA, tiras reactivas, inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPI) e inmunoensayo de flujo lateral (LFA)) (Agriopoulou et al., 2020), se pueden aplicar muchas otras técnicas emergentes para la detección de micotoxinas en los piensos.

BIOSENSORES

METODOLOGÍA

Este método de ensayo in situ, rápido, fácil, reproducible, estable, preciso y barato, requiere transductores (ópticos, piezoeléctricos o electroquímicos) para la detección de micotoxinas (Schulz et al., 2019).

APLICACIÓN

• Oliveria et al. (2019) reportaron el uso de biosensores para la detección de micotoxinas producidas por hongos micotoxigénicos en piensos y alimentos.
• El método detectó AFB₁, OTA, AFM₁, PAT, ZEN, FB1, T-2 y DON en polvo de maíz, maíz, cebada, trigo, maíz y productos de maíz (Hossain et al., 2019).
• Los sensores impedimétricos detectaron hongos micotoxigénicos productores de AFB₁, AFM₁, OTA y PAT en alimentos y piensos (Khan et al., 2019).
• Se utilizaron sensores fotométricos con un sistema de dos o tres electrodos para analizar con éxito la AFB₁ y el ZEN en el polvo de maíz y el maíz, respectivamente (He et al., 2019).
• También se han utilizado sensores amperométricos basados en un sistema de dos o tres electrodos para detectar el ZEN en el maíz y los productos a base de maíz (He et al., 2019).
• Los sensores de resonancia de plasmón superficial son sensibles y rentables con una alta especificidad para detectar DON, ZEN y la toxina T-2 en el trigo (Hossain et al., 2019).
• Los sensores de microbalanza de cristal de cuarzo detectaron AFB₁ en arroz y trigo (Gu et al., 2019).

NARIZ ELECTRONICA

METODOLOGÍA

La nariz electrónica incluye detectores no específicos que capturan compuestos orgánicos volátiles (VOCs) y detectan huellas volátiles cualitativas asociadas a los hongos toxigénicos.

⇰ El olor es la información preliminar para detectar los metabolitos producidos en la identificación de VOCs específicos relacionados con los hongos en las matrices de los piensos.

APLICACIÓN

• El método detecta las micotoxinas producidas por hongos micotoxigénicos, como las aflatoxinas, las fumonisinas en el maíz y el DON en el salvado de trigo, que es el principal ingrediente de los piensos (Ottoboni et al., 2018).

POLARIZACIÓN FLUORESCENTE (FP)

METODOLOGÍA

La PF trabaja con el analito y el trazador en el sitio de unión del anticuerpo. La unión del trazador al anticuerpo in luye en la rotación de la molécula del trazador aumentando el valor de la PF.

⇰ La cantidad de trazador es inversamente proporcional al analito libre en la muestra, lo que resulta en un valor de polarización inversamente proporcional a la concentración de analito.

APLICACIÓN

• El método detecta las especies de Fusarium que producen ZEN en el maíz y DON en los productos a base de trigo, así como las especies de Aspergillus que producen AFB₁ en el maíz, y OTA en el arroz (Huang et al., 2020).
• El método es preciso en comparación con el HPLC con una sensibilidad limitada (Zhang et al., 2018).

RMN CUANTITATIVA E IMÁGENES HIPERESPECTRALES

METODOLOGÍA

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se utiliza para la identificación de compuestos orgánicos y la metabolómica. Recientemente, se ha aplicado la RMN 2D y multidimensional.

La imagen hiperespectral es una técnica para la evaluación de micotoxinas fúngicas que funciona con menos costes sin destruir la muestra, siendo rápida y operando en la localización de datos espectrales.

APLICACIÓN

• La metabolómica basada en la RMN se ha utilizado para dilucidar el mecanismo de reordenación de la micotoxina de Fusarium, Fusarina C, en los piensos debido a su alto rendimiento de las muestras y a la metabolómica con rica información estructural (López-Ruiz et al., 2019).
• Las imágenes hiperespectrales se han utilizado principalmente para detectar la contaminación por DON y patógenos de Fusarium en los granos de trigo a granel (Femenias et al., 2020).

CONCLUSIONES

Algunas materias primas agrícolas, como el trigo, el maíz, la soja, el mijo perla, el sorgo y el arroz, se utilizan principalmente para la fabricación de piensos, que son los más demandados por las industrias ganaderas.

Por ello, la seguridad de los piensos es fundamental, ya que su consumo es una vía potencial de entrada de sustancias químicas peligrosas en la cadena alimentaria humana, incluidas las micotoxinas.

Debido a la amenaza que suponen las micotoxinas para la salud animal y humana, en la UE se han aplicado determinadas legislaciones a los productos basados en piensos destinados al ganado con el establecimiento de criterios de limitación verificados, así como el desarrollo de métodos sensibles y coherentes para detectar las micotoxinas.

Para detectar las micotoxinas y los hongos micotoxigénicos se aplican tecnologías basadas en la PCR y técnicas analíticas novedosas.

Son rápidas, rentables, precisas, sensibles, portátiles y seguras, para la detección en matrices de alimentos y piensos.

En la actualidad, existen muchos más métodos moleculares, como NASBA, FISH, SAGE, Northern blotting, método basado en sondas de ADN/ARN, PCR-ELISA, MCH-PCR, PCR de próxima generación, PCR cooperativa, ARN de interferencia. Sin embargo, aún no se han aplicado para la detección de hongos micotoxigénicos asociados a matrices de alimentos y piensos.

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